Introduction : L’infection chronique par le virus de l’hépatite B (VHB) reste un fardeau sanitaire mondial, car les stratégies antivirales actuelles sont incapables d’éliminer le virus des hépatocytes infectés et, par conséquent, d’obtenir une guérison complète. Des biomarqueurs non invasifs sont nécessaires pour améliorer la prise en charge des patients et l’évaluation de nouvelles thérapies. Cette étude vise à caractériser les compartiments contenant les ARN extracellulaires du VHB, qui ont été récemment proposés comme un nouveau marqueur de substitution de l’activité transcriptionnelle de l’ADNccc.

Patients et méthodes / ou matériel et méthodes :  Les surnageants d’hépatocytes primaires infectés et traités ou non par la lamivudine ont été traités par séparation en gradient de sucrose/iodixanol, afin de permettre la séparation physique des vésicules extracellulaires (EVs) et des particules virales. Les protéines associées aux EVs ont été analysées par Western Blotting et ELISA, tandis que les ARN du VHB ont été détectés par droplet digital (dd)PCR. L’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et la protéomique basée sur la spectrométrie de masse (MS) ont été utilisées pour caractériser davantage les composants viraux et non viraux.

Résultats :  Les analyses ELISA et western blotting pour les protéines HBs et HBc, ainsi que la quantification de l’ADN du VHB après séparation par gradient ont montré que les virions se trouvaient dans les fractions correspondant à une densité de 1,17-1,20 g/ml. L’expression de CD9, marqueur des exosomes/EVs, a été détectée uniquement dans les fractions de plus faible densité (1,07-1,15 g/ml), qui étaient dépourvues de HBc. L’analyse ddPCR utilisant des amorces couvrant la région 5′ de l’ARN 3,5 Kb ou la région HBx a suggéré que l’ARN 3,5 Kb est l’espèce d’ARN viral prédominante mais pas unique dans les surnageants cellulaires. La distribution des ARN-VHB dans les fractions de gradient n’a montré aucune différence significative entre les échantillons traités à la lamivudine et les échantillons non traités. Il est intéressant de noter que les ARN-VHB ont été détectés non seulement dans les particules de type virion et les capsides non enveloppées, mais aussi dans les fractions plus légères, ce qui suggère que les EVs peuvent également transporter l’ARN-VHB sécrété. L’analyse NTA a confirmé que ces fractions contenaient effectivement des EVs dont la taille variait de 30 à 150 nm et l’analyse MS a révélé un enrichissement significatif en protéines exosomales (CD63, CD9, TSG101 ou HSC70).

Conclusion : Nos résultats montrent la présence d’ARN du VHB dans les EVs et aideront à comprendre la biologie moléculaire de la sécrétion de l’ARN du VHB dans le sérum. Ces connaissances aideront au développement et à l’interprétation de l’ARN du VHB sérique comme nouveau biomarqueur de l’infection chronique par le VHB.

Conflit d’intérêt : AH et MH sont employés de Roche Diagnostics

Remerciements : Ce travail a été soutenu par une subvention publique supervisée par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR) dans le cadre du deuxième programme « Investissements d’Avenir » (ANR-17-RHUS-0003).