Introduction :
Les cellules étoilées hépatiques (HSC, hepatic stellate cells) jouent un rôle clé dans le processus de fibrose. Récemment, nous avons caractérisé chez la souris et l’humain atteints de fibrose, une population particulière de HSC qualifiée d’«hypertrophiées» (hypHSC) et dont la présence est corrélée au stade de fibrose. Notre objectif est de mettre au point la purification des hypHSC à partir d’un modèle murin de fibrose métabolique pour ensuite les caractériser par analyse transcriptomique.

Patients et méthodes / ou matériel et méthodes :
Des souris C57Bl/6 ont été nourries au régime CDAHFD (Choline-Deficient L-amino acid-defined High-Fat Diet) provoquant une fibrose. La purification des hypHSC nécessite une digestion in situ du foie, par un cocktail enzymatique perfusé dans le foie via la veine cave supérieure afin de dissocier les cellules. Un gradient de densité permet ensuite de séparer les cellules en fonction de leur densité (les HSCs ayant une faible densité par rapport aux autres cellules hépatiques en raison des gouttelettes de rétinoïdes qu’elles contiennent). Puis une dernière étape de tri cellulaire par FACS (Fluorescence Activating Cell Sorting) est réalisée avec un Astrios. Un séquençage du transcriptome (RNA-seq) par NGS (Next Generation Sequencing) des hypHSC et des HSC d’un foie sain (qHSC) a été réalisé.

Résultats :
Pour purifier les hypHSC à partir du foie d’une souris CDAHFD, nous avons adapté le protocole décrit dans la littérature. A la différence d’un foie sain, un foie de souris soumis au régime CDAHFD contient plus de collagène (fibrose) et plus de lipides (stéatose) ce qui a nécessité d’adapter la quantité d’enzymes, le temps et le débit de perfusion du foie. Après l’étape du gradient de densité, nous obtenons une préparation cellulaire contenant 40% de hypHSC.
Une étape supplémentaire de purification par FACS est nécessaire pour augmenter la pureté en hypHSC. Ainsi, la stratégie de tri mise au point au cours de ce travail consiste à effectuer une première sélection des cellules en fonction de leur taille et granularité, cette première sélection permet d’éliminer une grande partie des débris cellulaires. Puis une deuxième sélection des cellules en fonction de leurs propriétés intrinsèques et spécifiques de fluorescence dans le visible permet d’obtenir une préparation cellulaire purifiée contenant 95% de hypHSC.
Les résultats préliminaires de l’analyse par RNA-seq des hypHSC et des qHSC montrent que ces deux populations de HSC ont des profils d’expression génique bien différents (sur 16066 gènes trouvés, 6780 ont une différence d’expression significative).

Conclusion :
Le protocole de purification adapté au modèle de fibrose hépatique métabolique permet d’obtenir une préparation de hypHSC très enrichie (>95%). Les résultats préliminaires de l’analyse RNAseq montrent que les hypHSC se distinguent des qHSC par leur transcriptome. L’analyse approfondie des gènes différemment exprimés par les hypHSC permettra de mieux comprendre leur rôle dans la fibrose.

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêt

Références :
High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers”, Mederacke and al., 2015, Nature Protocols