Introduction :
Les cellules de la lignée HepaRG ont la capacité remarquable de se différencier en hépatocytes présentant un profil métabolique proche de celui des hépatocytes humains en culture primaire [1,2]. Le développement de technologies de transfert de gènes efficaces pour les cellules HepaRG est devenu primordial pour moduler l’expression des gènes et voies métaboliques hépatocytaires. Nous présenterons nos récentes optimisations en matière de transfert de gènes des cellules HepaRG différenciées.

Patients et méthodes / ou matériel et méthodes :
Pour la lipofection, des lipoplexes ont été formulés à l’aide d’un lipide cationique (Syn1) [3] et des plasmides codant la GFP (pMaxGFP) et le cytochrome P450 2D6 (CYP2D6). Pour l’électroporation, les cellules HepaRG ont été soumises à des impulsions électriques de 1500 volts pendant 20 millisecondes (dispositif Neon™) [4], pour le transfert du pMaxGFP et d’un ARNm synthétique codant la GFP. Des transductions lentivirales de cellules HepaRG progénitrices ont été réalisées pour obtenir un gain d’expression du CYP2E1 dans les cellules différenciées. L’expression de la GFP a été analysée par cytométrie en flux (Becton Dickinson LSR-Fortessa™ X-20 FACS et logiciel FACSDiva). L’expression des gènes a été étudiée par western-blot, RT-qPCR et dosages des activités enzymatiques.

Résultats :
Nous avons démontré que la lipofection permettait une forte expression de la GFP dans les cellules progénitrices HepaRG alors que dans les cellules différenciées, la transfection était peu efficace très probablement du fait de la quiescence de ces cellules. Nous avons optimisé une procédure de stimulation mitogénique des cellules différenciées et confirmé que la prolifération augmentait fortement l’efficacité de la lipofection. Cette procédure a été utilisée pour exprimer le CYP2D6 dans les cellules HepaRG [3]. Indépendamment, nous avons également dérivé des lignées cellulaires HepaRG transgéniques exprimant des niveaux plus élevés de CYP2E1. Les cellules progénitrices HepaRG transduites avec des lentivirus codant pour l’ADNc du CYP2E1 humain expriment de façon stable cette enzyme de phase I à des niveaux similaires à ceux des hépatocytes primaires. Ce variant cellulaire a été utilisé pour revisiter le métabolisme de la chlorzoxazone [5]. Plus récemment, nous avons optimisé l’électroporation des cellules HepaRG différenciées par de l’ARNm codant pour la GFP. Cette technologie permet une très grande efficacité d’expression du transgène, supérieure à celle obtenue avec du plasmide et qui peut être modulée en ajustant les quantités d’ARNm.

Conclusion :
L’ensemble de ces optimisations permet de développer de nouvelles approches pour la transfection transitoire et stable des cellules HepaRG différenciées ainsi que de nouvelles applications à l’utilisation de cette lignée cellulaire notamment par la modulation du niveau d’expression d’enzymes du métabolisme des xénobiotiques.

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intéret

Remerciements :
Biogenouest, Conseil Régional de Bretagne, ANRT, plateforme SynNanoVect, Biosit et plateforme cytométrie

Références :
[1] Aninat C, Piton A, Glaise D, Le Charpentier T, Langouët S, Morel F, Guguen-Guillouzo C, Guillouzo A. Expression of cytochromes P450, conjugating enzymes and nuclear receptors in human hepatoma HepaRG cells. Drug Metab Dispos. 2006 Jan;34(1):75-83.
[2] Rogue A, Lambert C, Spire C, Claude N, Guillouzo A. Interindividual variability in gene expression profiles in human hepatocytes and comparison with HepaRG cells. Drug Metab Dispos. 2012 Jan;40(1):151-8.
[3] Vlach M, Coppens-Exandier H, Jamin A, Berchel M, Scaviner J, Chesné C, Montier T, Jaffrès PA, Corlu A, Loyer P. Liposome-Mediated Gene Transfer in Differentiated HepaRG™ Cells: Expression of Liver Specific Functions and Application to the Cytochrome P450 2D6 Expression. Cells. 2022 Dec 2;11(23):3904.
[4] Laurent V, Fraix A, Montier T, Cammas-Marion S, Ribault C, Benvegnu T, Jaffres PA, Loyer P. Highly efficient gene transfer into hepatocyte-like HepaRG cells: new means for drug metabolism and toxicity studies. Biotechnol J. 2010 Mar;5(3):314-20
[5] Quesnot N, Bucher S, Gade C, Vlach M, Vene E, Valença S, Gicquel T, Holst H, Robin MA, Loyer P. Production of chlorzoxazone glucuronides via cytochrome P4502E1 dependent and independent pathways in human hepatocytes. Arch Toxicol. 2018 Oct;92(10):3077-3091.